ایمونوفلورسنت

تکنیک ایمنوفلورسانس (IFA) یکی از روش‌های ایمونواسی در حوزه پزشکی و بیولوژی است که از طریق آن می‌توان با دقت و سرعت بالا، آنتی‌بادی‌ها و پروتئین‌های خاص در نمونه‌های بیولوژیکی مختلف را شناسایی کرد. در این روش از آنتی‌بادی‌های نشاندار با ماده فلورسنت استفاده می‌شود. این روش به ویژه در تشخیص بیماری‌های خود ایمنی بسیار مؤثر است. با استفاده از این تکنیک، می‌توان آنتی‌بادی‌های خاصی که در نمونه‌های مختلف بیماران وجود دارد را شناسایی کرده و از این اطلاعات برای تشخیص دقیق‌تر بیماری‌ها بهره برد. ایمنوفلورسانس در تشخیص بیماری‌های عفونی مانند ویروس‌ها و باکتری‌ها نیز بسیار تعیین کننده است. میکروسکوپ ایمونوفلورسانس از تجهیزات مورد استفاده در این زمینه می‌باشد.این تکنیک به دو روش مستقیم (اولیه) و غیرمستقیم (ثانویه) تقسیم بندی می‌شود. معمولاً از روش ایمونوفلورسانس مستقیم، برای جستجو روسوب ایمونوگلوبین‌ها و یا اجزای سیستم کمپلمان در یک نمونه بیوپسی (بافت) استفاده می‌گردد. در این روش شناسایی هر آنتی‌ژن خاص توسط آنتی‌بادی‌های نشاندار شده با مواد فلورسانس صورت می‌گیرد. روش ایمونوفلورسانس مستقیم (Assay Fluorescence Immuno Direct: DIFA)از یک آنتی‌بادی منفرد استفاده می‌کند که از نظر شیمیایی به یک فلوروفور مرتبط است. آنتی‌بادی، مولکول هدف را شناسایی کرده و به آن متصل می‌شود و فلوروفور حامل آن از طریق میکروسکوپ قابل تشخیص خواهد بود. فلوروفور (که با نام فلوروکروم یا کروموفور نیز شناخته می‌شود) یک ترکیب شیمیایی فلورسنت است که می‌تواند با تحریک نور، آن را دوباره ساطع کند. فلوروفورها معمولاً شامل چندین گروه آروماتیک ترکیبی هستند. فلورسین از مشتقات ایزوتیوسیانات آمین و واكنش ایزوتیوسیانات فلورسئین (FITC) ، یكی از محبوب‌ترین فلوروفورها است. در تکنیک ایمونوفلورسانس غیرمستقیم (Assay Fluorescence Immuno Indirect: IIFA) از دو آنتی‌بادی استفاده می‌شود. آنتی‌بادی اولیه بدون برچسب به طور خاص به مولکول هدف متصل می‌گردد. در ادامه، آنتی‌بادی ثانویه که حامل فلوروفور است، آنتی‌بادی اولیه را شناسایی کرده و به آن متصل می‌شود. آنتی‌بادی‌های ثانویه متعدد می‌توانند به یک آنتی‌بادی اولیه متصل شوند. این وضعیت باعث تقویت سیگنال با افزایش تعداد مولکول‌های فلوروفور در هر آنتی‌ژن خواهد شد. ‌از ایمونوفلورسانس ثانویه اغلب برای تأیید نتایج مثبت بدست آمده توسط تکنیک ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) و MFIA (Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay) استفاده می‌شود.

تفاوت روش ایمونوفلورسانس مستقیم و غیرمستقیم

در ایمونوفلورسانس مستقیم تنها از یک آنتی‌بادی که به مواد فلوروسنت متصل شده است، استفاده می‌گردد اما در روش ایمونوفلورسانس غیرمستقیم از دو آنتی‌بادی استفاده می‌شود. روش مستقیم کاربرد محدودتری دارد و برای جستجوی آنتی‌ژن‌های ذره‌ای مانند میکروب‌ها ، سلول‌ها و رسوب کمپلکس‌های ایمنی مورد استفاده قرار می‌گیرد. روش غیرمستقیم مزیت‌های زیادی دارد از جمله اینکه نیازی به کونژوگه کردن آنتی‌بادی او با فلوروکروم نمی‌باشد. ضمناً، حساسیت این روش بیشتر است چون چندین آنتی‌بادی ثانویه فلورسنت می‌تواند به آنتی‌بادی اولیه متصل شده و میزان نور ساطع شده را افزایش دهند.