آزمایش ژنتیک ملکولی

مقدمه

Real-Time PCR که به عنوان (Quantitative PCR) qPCR نیز شناخته می‌شود، یک تکنیک آزمایشگاهی است که برای تشخیص سریع،دقیق و تعیین کمیت توالی‌های خاص DNA یا RNA در بیماری‌های ویروسی و غیر ویروسی استفاده می‌شود. علاوه بر کاربردهای تشخیصی، Real-Time PCR در موارد تحقیقاتی به منظور بررسی تغییرات تنظیم بیان ژن نیز تعیین کننده است. تفاوت اصلی بین Real Time PCR و PCR سنتی، شناسایی و کمی سازی محصولات تقویت کننده (Amplification products) می‌باشد. به علاوه،در PCR سنتی مقدار محصولات تولید شده را نمی‌توان تا پایان واکنش بررسی کرد و نتایج اغلب به عنوان “مثبت” یا “منفی” برای حضور توالی هدف گزارش می‌شوند.در یک نگاه کلی می‌توان گفت که Real-Time PCR به عنوان تکنیکی قدرتمند، انقلابی در زمینه تشخیص ژنتیک مولکولی فراهم کرده است. ضمناً، توانایی آن در تعیین کمیت توالی‌های خاص DNA یا RNA، آن را به ابزاری ارزشمند برای تشخیص و نظارت بر طیف گسترده‌ای از بیماری‌ها، نظیر عفونت‌های ویروسی تا اختلالات پیچیده ژنتیکی مبدل می‌سازد.

اصول Real-Time PCR

• DNA Amplification: مانند PCR سنتی، Real-Time PCR شامل تکثیر DNA است. این فرآیند از یک آنزیم DNA پلیمراز برای تکثیر توالی DNA هدف از طریق چرخه های مکرر Denaturation, Annealing و Extension استفاده می‌کند.
• Quantification: برخلاف PCR سنتی، Real-Time PCR مقدار DNA تولید شده در طول هر چرخه را اندازه گیری می‌کند. این امر با استفاده از رنگ‌های فلورسنت یا پروب‌هایی به دست می‌آید که هنگام اتصال به DNA دو رشته‌ای یا هیبرید شدن با توالی هدف، فلورسانس منتشر می‌کنند.

اجزای کلیدی کیت‌های مورد استفاده در Real-Time PCR

• DNA یا RNA الگو (Template DNA): نمونه حاوی DNA و یا RNA (در مورد نمونه‌های RNA ، سنتز cDNA نیز مورد نیاز است.) برای تکثیر.
• پرایمرهای Reverse and Forward : توالی‌های کوتاهی از نوکلئوتیدها که نقطه شروعی برای سنتز DNA را فراهم می‌کنند.
• DNA Polymerase : آنزیمی که رشته‌های جدیدی از DNA مکمل توالی هدف را سنتز می‌کند.
• نوکلئوتیدها (Nucleotides (dNTPs)) : نوکلئوتیدهایی که برای سنتز رشته DNA جدید استفاده می‌شوند.
• رنگ‌های فلورسنت/ پروب‎ها : مولکول‌هایی که پس از اتصال به DNA، فلورسانس ساطع کرده و امکان نظارت در واکنش را فراهم می‌کنند.

انواع موارد تشخیص فلورسنت Real-Time PCR

• SYBR Green: رنگی که به DNA دو رشته‌ای متصل می‌شود و فلورسانس منتشر می‌کند. با تولید DNA بیشتر، شدت فلورسانس افزایش می‌یابد.
• TaqMan Probes: پروب‌های توالی خاص با یک Fluorescent reporter  و یک Quencher  مشخص شده‌اند. هنگامی که پروب با DNA هدف هیبرید می‌شود، پلیمراز، Reporter را از Quencher جدا می‌کند و در نتیجه فلورسانس افزایش می‌یابد.
• Molecular Beacons: پروب‌های Hairpin-shaped  که با اتصال به DNA هدف فلورسانس می‌شوند.
• Scorpion Probes: پروب‌هایی که هم شامل پرایمر و هم Probe sequence  هستند که پس از هیبریداسیون با DNA هدف فلورسانس می‌شوند.

فازهای Real-Time PCR

• Linear phase : در این مرحله، مقدار توالی هدف در مخلوط واکنش به صورت خطی در حال افزایش است، زیرا DNA پلیمراز رشته‌های جدیدی از DNA را سنتز می‌کند. مقدار محصول تولید شده متناسب با مقدار DNA یا RNA الگو موجود در واکنش است. این مرحله معمولاً در ابتدای واکنش PCR، زمانی که غلظت توالی هدف کم است، رخ می‌دهد.
• Exponential phase : در این مرحله، مقدار توالی هدف در مخلوط واکنش به طور تصاعدی در حال افزایش است، زیرا DNA پلیمراز رشته‌های جدیدی از DNA را با سرعت فزاینده سنتز می‌کند. این فاز معمولاً پس از فاز خطی رخ داده، زمانی که غلظت توالی هدف به سطحی افزایش ‌یابد که سرعت واکنش در سوبسترا (dNTPs) یا فعالیت DNA پلیمراز محدود ‌شود، این مرحله به عنوان “فاز لگاریتمی” یا “فاز رشد نمایی” شناخته می‌شود.
• Plateau phase : در این مرحله، با اشباع شدن مخلوط واکنش از محصول، مقدار توالی هدف افزایش نمی‌یابد. این مرحله معمولاً پس از فاز نمایی رخ می‌دهد، زمانی که غلظت توالی هدف به سطحی رسیده است که سرعت واکنش توسط در دسترس بودن سوبستراها  (dNTPs)یا فعالیت DNA پلیمراز محدود می‌شود. این فاز به عنوان «فاز ثابت» نیز شناخته می‌شود.

مراحل Real-Time PCR              

• آماده‌سازی (Preparation): DNA الگو، پرایمرها، DNA پلیمراز، dNTPs و رنگ/پروب فلورسنت در یک لوله یا میکروتیوپ مخلوط می‌شوند.
• Denaturation : مخلوط واکنش تا حدود 95 درجه سانتیگراد گرم شده تا DNA دو رشته‌ای به حالت تک رشته‌ایی جدا شود.
• Annealing : مخلوط واکنش در حدود 50-65 درجه سانتیگراد خنک شده تا پرایمرها به توالی‌های مکمل خود روی DNA تک رشته‌ای متصل شوند.
• Extension : دما تا حدود 72 درجه سانتیگراد افزایش یافته تا DNA پلیمراز بتواند رشته‎های DNA جدیدی را با افزودن نوکلئوتیدها به پرایمرها سنتز کند.
• Detection: فلورسانس ساطع شده در هر چرخه اندازه‌گیری می‌شود. افزایش فلورسانس مربوط به مقدار DNA در حال تکثیر است.

تجزیه و تحلیل داده‌های Real-Time PCR

• Threshold Cycle (Ct) (چرخه آستانه) : تعداد چرخه‌ای که در آن فلورسانس از یک آستانه از پیش تعریف شده فراتر می‌رود. مقدار Ct با مقدار اولیه DNA هدف در نمونه نسبت معکوس دارد.
• Standard Curve (منحنی استاندارد) : نموداری است که رابطه بین مقادیر توالی DNA هدف و مقدار Ct مربوطه را نشان می‌دهد.
• Relative Quantification (کمیت نسبی): مقایسه مقادیر Ct ژن هدف با یک ژن مرجع (Reference gene) برای نرمال‌سازی (Normalize) تغییرات در مقدار DNA ورودی (Input DNA) است.

کاربردهای Real-Time PCR

• Gene Expression Analysis : دارای توانایی اندازه‌گیری سطوح بیان ژن‌های خاص در شرایط مختلف.
• Pathogen Detection: دارای توانایی شناسایی و تعیین کمیت DNA ویروسی یا باکتریایی در نمونه‌های بالینی.

 Genotyping: توانایی تشخیص تغییرات ژنتیکی مانند پلی مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی (Single Nucleotide Polymorphisms :SNPs)

• Copy Number Variation : توانایی تعیین تعداد نسخه‌های یک ژن خاص در ژنوم.

مزیت‌های Real-Time PCR

• حساسیت (Sensitivity): حساسیت بالا می‌تواند مقادیر بسیار کم DNA را تشخیص دهد.
• اختصاصیت (Specificity) : اختصاصیت بالا به دلیل استفاده از پروب‌های توالی خاص است.
• کمی بودن (Quantitative): داده‌های کمی را در مورد مقدار DNA هدف ارائه می‌دهد.
• سرعت : سریع‌تر از PCR سنتی است زیرا نیاز به پردازش پس از PCR را از بین می‎برد.

محدودیت‌های Real-Time PCR

• هزینه: پر هزینه بودن به دلیل نیاز به تجهیزات و کیت‌های تخصصی.
• پیچیدگی (Complexity) : به بهینه‌سازی و اعتبارسنجی دقیق پرایمرها و پروب‎ها نیاز دارد.
• مهارکنندگی Inhibition)) : وجود بازدارندها (inhibitors) در نمونه‌ها می‌تواند بر صحت نتایج تأثیر بگذارد.

نتیجه‌گیری

Real-Time PCR به طور گسترده در تحقیقات، تشخیص بالینی و بیوتکنولوژی به دلیل توانایی آن در ارائه کمی‌سازی سریع و دقیق اسیدهای نوکلئیک استفاده می‌شود.